Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒利用FITC标记的Annexin V作为探针来检测细胞早期凋亡的发生，这使得它成为细胞凋亡检测实验中最常用的探针组合。

检测原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞质转移到细胞外空间，暴露于外部环境，并增加细胞膜的通透性，从而被特异性针对PS的Annexin-V探针标记。

Annexin-V是一种依赖钙的磷脂结合蛋白，对PS具有很强的亲和力。PI是一种经济且稳定的核酸染料，它不能穿透正常或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但能够穿透晚期凋亡和坏死细胞的细胞膜，使细胞核呈现红色。

当Annexin V与PI联合使用时，PI被排除在活细胞和早期凋亡细胞之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞则同时被FITC和PI双重染色。
 

图1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测原理

流式细胞分析

FITC具有最大激发波长488纳米和最大发射波长525纳米。FITC的绿色荧光在FL1通道被检测。

PI-DNA复合物的最大激发波长为535纳米，最大发射波长为615纳米。PI的红色荧光在FL2或FL3通道被检测。
 

图2. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测结果

在凋亡实验中，经常出现假阳性或与预期不符的结果。可能的原因包括补偿调整不当、细胞浓度过高、消化过度、药物干扰、药物处理时间过长、样本自身问题等因素。接下来，我将向您展示如何获得完美的结果图像。

01. 补偿调整不当：当激光激发时，荧光团在不同波长发射荧光。理论上，每种荧光都可以通过选择合适的滤光片，由相应的探测器检测到，而不受其他荧光团的干扰。然而，这些荧光团目前的发射光谱范围较宽。尽管它们的发射峰值不同，但在发射光谱范围内存在一定的重叠。换句话说，相邻的探测器会检测到彼此的荧光信号，影响检测结果的准确性。因此，在多色分析中必须进行光谱重叠校正。
 

图3. FITC和PI的发射光谱

调整方法：设置对照

空白管：使用未经染料处理的诱导凋亡的细胞，来调整荧光通道的光电倍增管电压。

单染管：需要分别含有仅PI和用荧光标记的Annexin V的管子，来调整两个荧光通道的补偿值。荧光团之间的补偿值应该保持不变。在双荧光染色时，如果一个荧光信号强而另一个弱，就必须进行补偿。补偿只应该应用于由相同激光激发的不同荧光团之间，以避免补偿不足和过度补偿。[3]
 

02. 细胞浓度过高：细胞浓度过高会导致培养基迅速消耗，从而引起因饥饿导致的凋亡。因此，应努力确保在诱导细胞凋亡之前细胞处于最佳状态。随后，应进行凋亡诱导处理，以避免因细胞衰老引起的凋亡。

图4. 细胞浓度过高导致自发性凋亡，空白对照组（左），实验组（右）

03. 细胞消化过度：对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤，消化液应含有不含EDTA的胰蛋白酶，因为Annexin V与PS的结合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+的螯合剂。使用含有EDTA的胰蛋白酶可能导致假阴性结果。在细胞消化过程中，胰蛋白酶可以铺满培养板底部，并轻轻摇晃以确保与细胞充分接触。然后，应去除大部分胰蛋白酶，用剩余的少量胰蛋白酶进行进一步消化。当细胞间隙增大，瓶底出现斑点时，可以停止消化。需要轻柔地吹打以避免过度消化和机械损伤，这两者都可能对细胞膜造成损害，导致假阳性结果。

图5. 细胞消化过度导致89.15%的细胞进入早期凋亡状态

04. 凋亡诱导药物的荧光干扰：在下图中，未经处理的空白对照组（左）显示早期凋亡细胞占3.38%，晚期凋亡细胞占6.64%。然而，在右侧的图像中，Q1和Q2象限中的细胞占90%，几乎所有细胞在PI通道产生荧光，表明药物存在荧光干扰。因此，在选择合适的试剂盒时，应尽量避免药物和细胞内源性荧光信号的干扰。

图6. 药物本身引起的荧光干扰：空白对照组（左）和用药物处理的细胞（右）。
 

05. 样本存放时间过长或药物处理时间过长：样本处理后，应尽快进行流式细胞分析。样本存放时间过长或药物处理时间过长也可能导致细胞进入晚期凋亡和坏死阶段。如下图所示，空白对照组显示正常结果，但药物处理组显示出大量晚期凋亡细胞，这表明药物处理时间过长可能是原因所在。

图7. 药物处理时间过长：空白对照组（左）和用药物处理的细胞（右）

06. 检测样本：神经细胞

(1) 如果检测样本为神经细胞，神经细胞膜容易受损和翻转，导致假阳性。因此，用于检测细胞凋亡的Annexin V/PI双重染色流式细胞仪方法不适用于神经细胞。

(2) 检测样本来源：血液

如果样本来源于血液，必须从血液中去除血小板。血小板含有PS，能够与Annexin V结合，干扰实验结果。为了去除血小板，可以使用含有EDTA的缓冲液，随后进行200 g的离心处理。