蛋白质根据样品的纯度，鉴定精度的要求不同，可以分为对一级质谱，二级质谱（即串联质谱）。很多刚接触蛋白质鉴定的新手很可能对一级、二级质谱鉴定方法还不太了解。在这期文章中，小编就通过蛋白质鉴定的流程来系统地帮大家梳理一下蛋白质鉴定的基础知识，帮助大家选用适合的蛋白质鉴定方法。

如下图所示，蛋白质质谱鉴定一般都包含几个过程：蛋白质分离、蛋白质酶切、一级质谱鉴定、二级质谱鉴定。蛋白质分离是指蛋白质从细胞中分离纯化的过程，在进入质谱仪分析前需要对纯化的蛋白质酶切成多肽片段，经过一级、二级两个层级的质谱分析对蛋白质进行逐级分析，随着层级的加深，蛋白质序列分析的精度，蛋白质鉴定的准确度也得到提升。

蛋白质质谱鉴定

一、蛋白分离纯化

在对细胞中的蛋白质分析鉴定前，首先需要对细胞进行破碎，将总蛋白质分离提纯，接着再将目标蛋白分离出来，进行进一步分析。然而在蛋白质分离纯化的过程中也有一下可能影响后续蛋白质鉴定效率的因素需要考虑： 1、蛋白质浓缩

蛋白质样品可以用沉淀，膜分离，分离柱，冷冻干燥等各种方式进行浓缩， 具体蛋白浓缩方法应根据样品的特点进行选择，可用SDS样品液从色谱样上中洗脱蛋白，从而保持样本体积较小。

2、蛋白质凝胶电泳

对于SDS- PAGE，传统的Laemmli式，三甘氨酸凝胶及其各种改进型的凝胶，如二，三凝胶或三盐酸凝胶， 都可以兼容于蛋白质鉴定。各种凝胶浓度也没有限制。用户选择凝胶的类型，应根据能够实现对样本的更好的分离效果而定。 出于未知原因，三，黄酮凝胶与蛋白质识别的相容性要差一些。

3、蛋白质凝胶染色

传统的考马斯（G250或R - 250）染色剂能够有效地对蛋白质的染色。胶状考马斯染色剂包有更低的检测范围 (~5 ng BSA)。其他的染色方法，如锌/铜染色，荧光染料染色，银染色法都是可以用于蛋白质鉴定。

4、蛋白条带切割

凝胶在切割过程中应避免与手，灯箱， 或任何其他可能的角蛋白污染源直接接触。在切割蛋白胶带适应尽量避免割下空白凝胶（它可能降低酶切的消化效率和多肽的回收率）。 将每个凝胶带置于干净的，1.5毫升的微型离心管并给每个样本小心地做上标签。

二、蛋白质酶切消化

蛋白质在质谱鉴定前通常需要经过蛋白质酶切消化步骤，将大分子蛋白质酶切成多肽片段，以便于提升质谱鉴定的精度。蛋白质酶切通常选用胰蛋白酶进行蛋白质酶切处理，有时也会根据预测的蛋白质序列选测多种其他蛋白酶进行酶切。蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，再经过高效液相色谱对多肽片段进行初步分离，以进一步提升质谱鉴定的准确度。

三、蛋白质一级质谱鉴定

蛋白质一级质谱鉴定主要便是通过测定蛋白质酶切产生的肽段质量图谱，即肽质指纹谱（peptide mass fingerprint，PMF），再将测定的肽质量与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来"断裂"蛋白所产生的）。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数作一排行榜，"冠军"肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。

肽段在质谱分析前首先经过离子化，时肽段带上一定量的电荷。通过检测器分析，可得到各肽段的质荷比（m/z），从而得知各肽段的相对分子质量。目前常用的离子化的方法有两种：基质辅助激光解析电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）。MALDI电离的基本原理是将蛋白样品点在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。ESI电离是在毛细管的出口处施加一高电压，产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。

蛋白质质谱鉴定流程

四、蛋白质串联质谱鉴定

在第一阶段进行肽质指纹鉴定之后，一个有意义且丰度高的肽片段在质谱仪被选作"母离子"，母离子飞行至耳机质谱反应器中碰撞碎裂为"子离子"。在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。 连续的片段间差异即是肽片段的氨基酸质量。由氨基酸的质量可以推测出氨基酸的类别以及氨基酸上面可能发生的翻译后修饰。连续测得的氨基酸序列组成肽序列标签。然后，使用多个肽序列标签与数据库中蛋白质的序列进行比对，鉴定出目的蛋白质。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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